紫外分光光度计法测定不同产地瓜馥木中黄酮含量

黄酮类化合物是瓜馥木中主要活性成分之一 ,笔者通过建立不同产地瓜馥木中总黄酮的紫外分光光度计测定方法,以期为瓜馥木药材的质量控制 ,中药瓜馥木的用药安全性控制提供依据。
1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1 研究对象。瓜馥木 , 2005年采自广西临桂 ,由广西师范大学生命科学院唐绍清教授鉴定为瓜馥木 [ Fisistigm aoldhami(Hemsl.)Mer.]。

1.1.2 主要试剂。芦丁对照品(批号:080 -9303),中国药品生物制品检定所提供;其他试剂均为市售分析纯。 1.1.3 主要设备：UV1901PC紫外可见分光光度计、超声波清洗机、 旋转蒸发仪;电子天平,。

1.2  方法

1.2.1 对照品溶液制备。精密称取芦丁对照品适量(约 10 mg),置于 25.0 ml容量瓶中,加入体积分数为 70%的乙醇超声溶解并稀释至刻度,摇匀 ,即得对照品溶液。
1.2.2 供试品溶液的制备。精密称取瓜馥木药材约 1.0 g, 置于 250.0 ml圆底烧瓶中,加入 100.0 ml体积分数为 70%
乙醇,加热回流 2 h,放冷 ,补重 ,过滤 ,精密吸取滤液 3.0 ml, 蒸干,残渣加约 2.0 ml水溶解,通过聚酰胺色谱柱, 依次用水、50%乙醇、90%乙醇洗脱至无色 ,合并 50%乙醇和 90%乙醇洗脱液,蒸干,备用。

1.2.3  显色条件的考察。

1.2.3.1 加热时间的考察 。精密吸取药材溶液 5份,每份 2.0 ml,置于加有镁粉 250 mg的具塞刻度试管中,置于冷水浴中,逐渐滴加浓 HCl3.0 ml,并不时振摇试管,后加入70%乙醇至 7.0 ml,摇匀 ,置于沸水浴中分别加热 20、40、60、80、100 min,取出,迅速冷却至室温后再加入 70%乙醇补足至 7.0 ml,摇匀,依次测定吸光度。

1.2.3.2 镁粉用量的考察。精密吸取药材溶液 5份,每份 2.0 ml,分别置于加有不同量镁粉的具塞刻度试管中,置于冷水浴中,逐渐滴加浓 HCl3.0 ml,并不时振摇试管;后加 70%乙醇至 7.0 ml,摇匀,置沸水浴中加热 1 h,取出,迅速冷却至室温后再加入 70%乙醇补足 7.0 ml,摇匀,依次测定吸光度值。

1.2.4.1 测定波长的确定。分别精密吸取芦丁对照品溶液 1.0 ml和供试品溶液 2.0 ml,置于加有 250 mg镁粉的具塞刻度试管中,置于冷水浴中,逐渐滴加浓 HCl3.0 ml,并不断振摇试管,后滴加入 70%乙醇至 7.0 ml,振摇均匀,放置沸水浴中加热 1 h,迅速冷却至室温后再加入 70%乙醇补足至 7.0 ml,摇匀,在 400 ～ 800 nm范围内测定紫外吸收光谱,确定测定波长。 1.2.4.2 线性关系考察。精密吸取芦丁对照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 ml,分别置于加有镁粉 250 mg的

具塞刻度试管中,置于冷水浴中,逐渐滴加浓 HCl3.0 ml,并不时振摇试管,后加 70%乙醇补足至 7.0 ml,摇匀,置沸水浴中加热 1 h,取出 ,迅速冷却至室温后再加入 70%乙醇补足至 7.0 ml,摇匀,于测定波长处测定吸光度值。以芦丁对照品浓度(X)为横坐标,吸光度 (Y)为纵坐标,计算回归方程。 1.2.4.3 稳定性试验 。精密吸取芦丁对照品溶液 1.0 ml和供试品溶液 2.0 ml,显色后 ,分别在第 0、15、30、45、60 min测定吸光度值。计算相对标准偏差值(RSD)。

1.2.4.4 精密度试验。精密吸取供试品溶液 3.0 ml,置于加有镁粉 250 mg的具塞刻度试管中,按 “1.2.4.1”中方法测定吸光度值 ,连续测定 6次,计算 RSD值。

1.2.4.5 重复性试验 。精密称取同一批瓜馥木药材 6份,每份约 25 mg,分别置于 50.0 ml容量瓶中 ,加入 70%乙醇超声溶解,定容至刻度,摇匀 ,备用。精密吸取 3.0 ml溶液 ,按“1.2.4.1”中方法测定吸光度值,计算 RSD值。

1.2.4.6 加样回收率试验。取同一批瓜馥木药材 6份,每份约 5 mg,分别置于 10.0 ml容量瓶中,按照“1.2.2”中方法制备样品溶液,分别精密加入浓度为 0.434 8 mg/ml的芦丁对照品溶液 0.1 ml,再加入 70%乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀。精密吸取 2.0 ml样品测定,计算平均回收率及 RSD值。

1.2.5 不同产地瓜馥木黄酮含量测定。精密称取 3批瓜馥木药材粉末各约 1.0 g,分别置于 250.0 ml圆底烧瓶中,按“1.2.2”中方法制成供试品溶液 ,按“1.2.4.1”中方法测定吸光度值,计算黄酮含量。

2  结果与分析

2.1  显色条件考察结果

2.1.1 加热时间的考察 。加热时间对吸光度值的影响可知 ,加热 60 min时吸光度大,故显色时间选择 60 min。

2.1.2 镁粉用量的考察。结果表明,镁粉用量为 250 mg时吸光度大,故镁粉用量选择 250 mg。
2.2  方法学考察结果

2.2.1 测定波长的确定 。芦丁对照品和待测样品显色前后的吸收紫外光谱可知,对照品和样品均在 516 nm处有大吸收,故确定 516 nm为测定波长。

2.2.2 线性关系考察结果。计算得回归方程为 Y=7.490 9X -0.025 6(r=0.9991),表明在0.0056 ～ 0.1120mg/ml范围2.2.3 稳定性。芦丁对照品和药材溶液显色后 60 min内基本稳定,计算得 RSD值为 1.12%和 1.28%(n=5)。

2.2.4 精密度。计算得 RSD值为 0.45%,表明试验精密度良好。

2.2.5 重复性。计算 RSD值为 0.28%,表明该方法重复性良好。

2.2.6  回收率。回收率测得结果见表 1。由表 1可知,平均回收率为 99.76%, RSD值为 2.85%。

2.3  不同产地瓜馥木黄酮含量测定结果 不同产地瓜馥木黄酮含量测定见表 2。由表 2可知,产地 7 的瓜馥木中黄酮含量高,为 0.833%。

3  结论与讨论

(1)在考察显色方法的过程中,笔者曾采用 NaNO2-Al(NO3 )3-NaOH比色法 ,但该方法样品大吸收波长与对照品大吸收波长相差较大,而且用该反应测定黄酮类化合物专属性较差 ,终采用盐酸镁粉比色法作为瓜馥木总黄酮含量测定方法。

(2)考察显色条件时,由于药材中杂质较多,成分比较复杂 ,该研究对药材提取物,采用聚酰胺树脂进行了初步的纯化,以便获得较好的峰形。

(3)采用紫外分光光度法测定了 7445个不同产地瓜馥木中
总黄酮的含量,除了 6、8和 9 号 9398个产地的含量略微低于0.8%,其他产地的总黄酮含量基本稳定。测定结果的 RSD值均符合要求,说明该方法准确、稳定、可行。